三氯丙烷降解途徑的構(gòu)建及優(yōu)化
人工合成有機(jī)鹵化物1,2,3-三氯丙烷(TCP)是近年來公認(rèn)的一個地下水污染物,主要作為溶劑、土壤熏蒸劑前體及合成其他化合物的前體大量使用,截止2013年,TCP在全世界的生產(chǎn)數(shù)量已達(dá)每年50000噸,龐大的生產(chǎn)量造成諸多工業(yè)廢物排放到環(huán)境當(dāng)中,威脅著人類健康。而傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法的治理效果往往達(dá)不到要求,且容易造成二次污染。
因此,應(yīng)用生物降解該類化合物已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。微生物降解途徑中含有鹵代烷烴脫鹵酶、鹵醇脫鹵酶及環(huán)氧化物水解酶三種關(guān)鍵酶,游離狀態(tài)下的酶對環(huán)境變化十分敏感,易變性失活。本研究將采用交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)固定化技術(shù),將酶進(jìn)行有效的固定,應(yīng)用到環(huán)境污染物TCP降解途徑的構(gòu)建中,并通過條件優(yōu)化,提高TCP的降解效率。研究采用pBAD原核表達(dá)載體,通過條件優(yōu)化,得到鹵代烷烴脫鹵酶、鹵醇脫鹵酶、環(huán)氧化物水解酶可溶性表達(dá)量分別為20%、50%、50%的高效表達(dá)體系,為實(shí)現(xiàn)應(yīng)用CLEAs技術(shù)固定化酶奠定了基礎(chǔ)。在已有的CLEAs固定化技術(shù)的基礎(chǔ)之上,通過反應(yīng)溫度、添加劑、沉淀劑、交聯(lián)劑、交聯(lián)時間等條件優(yōu)化,最終得到固定化鹵代烷烴脫鹵酶及固定化鹵醇脫鹵酶達(dá)90%以上的酶活保留,固定化環(huán)氧化物水解酶達(dá)50%以上的酶活保留。
通過對最優(yōu)條件下固定化鹵醇脫鹵酶的性能研究表明,CLEAs技術(shù)固定化酶具有較好的熱穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性、有機(jī)耐受性、可回收利用性,對底物催化也具有較高的對映體選擇性。因而該技術(shù)固定化酶具有較高的研究價值,可進(jìn)一步應(yīng)用于TCP多酶降解途徑的研究中。TCP多酶降解途徑中,對三種酶的添加順序、添加比例及添加量進(jìn)行了優(yōu)化研究。結(jié)果表明:按反應(yīng)先后順序依次添加三種酶比同時添加得到的TCP的降解率高出14%以上;當(dāng)添加三種酶比例為1:1:1時,得到的TCP降解效率最高;當(dāng)添加酶的總質(zhì)量為30 mg時,TCP的降解率最高,經(jīng)過2h的反應(yīng),TCP降解效率可達(dá)到97%以上,并成功檢測到甘油的生成。固定化體系經(jīng)過5次反復(fù)使用后,TCP的降解率仍然可達(dá)75%以上。綜上所述,本研究構(gòu)建了一種基于多酶級聯(lián)策略的高效TCP降解途徑。
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